样本收集手册 | 细胞和细胞培养液的收集方法及注意事项
细胞样本样品量要求:1*107 cell/sample,提供两份样本,其中一份作为备份,分两管盛放。淬灭试剂准备:称取85g AMBIC(碳酸氢铵)加入到1000ml超纯水中,得到85g/l的AMBIC溶液。然后量取600ml 甲醇,100ml AMBIC (85g/l),290ml 超纯水水,混合,用12M 盐酸调节pH至7.4,*后用超纯水定容至1L即可。注意:由于pH的变化,淬灭试剂*好现配现用。悬浮细胞[1]样本收集步骤:1. 对细胞进行计数,计算1*107个细胞所需要的体积(即1体积);2. 取5体积的淬灭试剂于试管中(试管的体积应为大于等于7体积),置于-20℃预冷;3. 快速从细胞培养液中取出1体积的细胞,放入含有淬灭试剂的试管中;4. 轻微震荡试管10s,在1000g,4℃下离心1min,若细胞较小或细胞未沉淀,可适当加大转速或延长离心时间,但不宜一次提升太多,以防止细胞破损;5. 除去上清;6. 将细胞放入液氮,30s后取出置于-80℃保存。贴壁细胞酶消化法[2]样本收集步骤:1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次;2. 除去 PBS 溶液(一定要将 PBS 去除干净,越快越好);3. 消化:加入胰酶,消化至部分细胞呈球状;然后加入培养基,轻轻晃动,使培养基浸润细胞终止消化,吸出剩余培养基;加入 PBS 吹打,悬浮细胞;(目的是把贴壁细胞消化下来,方便后继处理,加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改);4. 快速计数,取1*107个细胞所需要的体积(即1体积);5. 快速放入预冷的5体积的淬灭试剂中,轻微震荡离心管 10s;6. 转子-20℃预冷,在 4℃,1000g 条件下离心 1min,若细胞较小或未沉淀,可适当加大转速或延长离心时间,但不宜一次提升太多,以防止细胞破损;7. 除去上清,将细胞放入液氮中,30s 后取出保存在-80℃中。刮细胞法(针对很难用酶消化下来的贴壁细胞)[2]样本收集步骤:1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次;2. 除去 PBS 溶液(越快越好);(不能计数的话,建议测代谢物之前做蛋白定量)3. 加入5体积淬灭试剂淬灭后用细胞刮分离细胞,将刮下的细胞转入离心管中;4. 在4℃,1000g 条件下离心 1min 去除上清。5. -80℃保存,干冰运输。注意事项:1. 取对数生长期,培养至同一时期的细胞,建议多准备样本,以备后续使用;2. 液氮处理细胞时,注意防止离心管破碎导致样本受损;3. 为防止样本收集过程中细胞膜破裂,建议在全程操作不宜过度剧烈,切勿涡旋震荡、高速离心或超声等,同时避免反复冻融,以保证细胞膜不会破损,减少代谢组学分析影响;4. PBS清洗时,切勿冲走细胞,清洗充分后,尽量将PBS完全倒掉。收集方法参考文献:[1]Christopher A Sellick, Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling, nature protocol, 2011.[2]Rahul Vijay Kapoore, Cell line dependence of metabolite leakage in metabolome analyses of adherent normal and cancer cell lines, metabolomics,2015.无需淬灭剂细胞样本收集方法(备选方法,一般不建议使用)悬浮细胞[1,2]样本收集步骤:1. 收集细胞并记数,1*107 cell/sample。2. 将收集的细胞进行4℃离心,5min,1200rpm。3. 使用PBS洗涤细胞,并在900rpm条件下离心。重复三次,去除PBS(尽量将PBS去除干净)4. 将含有细胞的EP管,迅速放入液氮中30s。5. 放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。贴壁细胞刮细胞法[3]样本收集步骤:1. 将细胞用PBS进行多次清洗。2. 用细胞刮将细胞刮入微离心管中,。3. 将EP管迅速放入液氮中30s,然后进行冻干。4. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。酶消化法[4]样本收集步骤:1. 除去细胞培养基,迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞,清洗两次。2. 除去 PBS 溶液(一定要将 PBS 去除干净,越快越好)。3. 消化:加入胰酶,消化至部分细胞呈球状;然后加入培养基,轻轻晃动,使培养基浸润细胞终止消化,吸出剩余培养基;加入 PBS 吹打,悬浮细胞;(目的是把贴壁细胞消化下来,方便后继处理,加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改)。4. 快速计数,取 1 体积的细胞。5. 转子-20℃预冷,在 4℃,2500g 条件下离心 5min。6. 去除上清,迅速放入液氮速冻30s,-80℃保存。干冰寄送。收集方法参考文献:[1]Dehui Xu, Yujing Xu et al. Alteration of metabolite profling by cold tmospheric plasma treatment in human myeloma cells. Cancer Cell Int. 2018[2]Zuzana Racovaa, Eva Anzenbacherova,et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2). Journal of Nutritional Biochemistry. 2020[3]Sarah Hayton, arth L. Maker et al. Experimental design and reporting standards for metabolomics tudies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017[4]Katja Dettmer,Nadine Nürnberger et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 2011.细胞培养液样品量要求:200μL/sample,提供两份样本并分 2 个离心管存放(条件允许*好 500μL/sample)。样本收集步骤:1.将培养液摇匀,快速从培养瓶中取出一定量的培养液,4℃条件下离心(1000g,10min);2.移取上清 500μL 至新的离心管中, 迅速放入液氮中淬灭,30s;3.淬灭后放入-80℃中保存。注意事项:寄送样本时请放入足量的干冰以保持低温条件【经验值:快递途中干冰消耗率约为 5KG/天,消耗速度与气温,泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系,请酌情添加干冰】。收集方法参考文献:[1]Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ,Analytical biotechnology, 2005.[2]Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.[3]Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: uenching and Extraction Protocols, metabolites, 2017.