细胞样本

• 样品量要求：

1*107 cell/sample，提供两份样本，其中一份作为备份，分两管盛放。

• 淬灭试剂准备：

称取85g AMBIC（碳酸氢铵）加入到1000ml超纯水中，得到85g/l的AMBIC溶液。然后量取600ml 甲醇，100ml AMBIC (85g/l)，290ml 超纯水水，混合，用12M 盐酸调节pH至7.4，＊后用超纯水定容至1L即可。

注意：由于pH的变化，淬灭试剂＊好现配现用。

悬浮细胞[1]

• 样本收集步骤：

1. 对细胞进行计数，计算1*107个细胞所需要的体积（即1体积）；

2. 取5体积的淬灭试剂于试管中（试管的体积应为大于等于7体积），置于-20℃预冷；

3. 快速从细胞培养液中取出1体积的细胞，放入含有淬灭试剂的试管中；

4. 轻微震荡试管10s，在1000g，4℃下离心1min，若细胞较小或细胞未沉淀，可适当加大转速或延长离心时间，但不宜一次提升太多，以防止细胞破损；

5. 除去上清；

6. 将细胞放入液氮，30s后取出置于-80℃保存。

贴壁细胞

• 酶消化法[2]

• 样本收集步骤：

1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次；

2. 除去 PBS 溶液（一定要将 PBS 去除干净，越快越好）；

3. 消化：加入胰酶，消化至部分细胞呈球状；然后加入培养基，轻轻晃动，使培养基浸润细胞终止消化，吸出剩余培养基；加入 PBS 吹打，悬浮细胞；

（目的是把贴壁细胞消化下来，方便后继处理，加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改）；

4. 快速计数，取1*107个细胞所需要的体积（即1体积）；

5. 快速放入预冷的5体积的淬灭试剂中，轻微震荡离心管 10s；

6. 转子-20℃预冷,在 4℃，1000g 条件下离心 1min，若细胞较小或未沉淀，可适当加大转速或延长离心时间，但不宜一次提升太多，以防止细胞破损；

7. 除去上清，将细胞放入液氮中，30s 后取出保存在-80℃中。

• 刮细胞法（针对很难用酶消化下来的贴壁细胞）[2]




• 样本收集步骤：

1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次；

2. 除去 PBS 溶液（越快越好）；（不能计数的话，建议测代谢物之前做蛋白定量）

3. 加入5体积淬灭试剂淬灭后用细胞刮分离细胞，将刮下的细胞转入离心管中；

4. 在4℃，1000g 条件下离心 1min 去除上清。

5. -80℃保存，干冰运输。

• 注意事项：

1. 取对数生长期，培养至同一时期的细胞，建议多准备样本，以备后续使用；

2. 液氮处理细胞时，注意防止离心管破碎导致样本受损；

3. 为防止样本收集过程中细胞膜破裂，建议在全程操作不宜过度剧烈，切勿涡旋震荡、高速离心或超声等，同时避免反复冻融，以保证细胞膜不会破损，减少代谢组学分析影响；

4. PBS清洗时，切勿冲走细胞，清洗充分后，尽量将PBS完全倒掉。

收集方法参考文献：

[1]Christopher A Sellick, Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling, nature protocol, 2011.

[2]Rahul Vijay Kapoore, Cell line dependence of metabolite leakage in metabolome analyses of adherent normal and cancer cell lines, metabolomics,2015.

无需淬灭剂细胞样本收集方法
（备选方法，一般不建议使用）

悬浮细胞[1,2]

• 样本收集步骤：

1. 收集细胞并记数，1*107 cell/sample。

2. 将收集的细胞进行4℃离心，5min，1200rpm。

3. 使用PBS洗涤细胞，并在900rpm条件下离心。重复三次，去除PBS（尽量将PBS去除干净）

4. 将含有细胞的EP管，迅速放入液氮中30s。

5. 放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。

贴壁细胞

• 刮细胞法[3]

• 样本收集步骤：

1. 将细胞用PBS进行多次清洗。

2. 用细胞刮将细胞刮入微离心管中，。

3. 将EP管迅速放入液氮中30s，然后进行冻干。

4. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。

• 酶消化法[4]

• 样本收集步骤：

1. 除去细胞培养基，迅速用预冷的 PBS 溶液清洗细胞，清洗两次。

2. 除去 PBS 溶液（一定要将 PBS 去除干净，越快越好）。

3. 消化：加入胰酶，消化至部分细胞呈球状；然后加入培养基，轻轻晃动，使培养基浸润细胞终止消化，吸出剩余培养基；加入 PBS 吹打，悬浮细胞；（目的是把贴壁细胞消化下来，方便后继处理，加入的溶液量及孵育时间可以根据自己实验室具体情况进行修改）。

4. 快速计数，取 1 体积的细胞。

5. 转子-20℃预冷,在 4℃，2500g 条件下离心 5min。

6. 去除上清，迅速放入液氮速冻30s，-80℃保存。干冰寄送。

收集方法参考文献：

[1]Dehui Xu, Yujing Xu et al. Alteration of metabolite profling by cold tmospheric plasma treatment in human myeloma cells. Cancer Cell Int. 2018

[2]Zuzana Racovaa, Eva Anzenbacherova,et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2). Journal of Nutritional Biochemistry. 2020

[3]Sarah Hayton, arth L. Maker et al. Experimental design and reporting standards for metabolomics tudies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017

[4]Katja Dettmer,Nadine Nürnberger et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 2011.

细胞培养液

• 样品量要求：

200μL/sample，提供两份样本并分 2 个离心管存放（条件允许＊好 500μL/sample）。

• 样本收集步骤：

1．将培养液摇匀，快速从培养瓶中取出一定量的培养液，4℃条件下离心（1000g，10min）；

2．移取上清 500μL 至新的离心管中, 迅速放入液氮中淬灭，30s；

3．淬灭后放入-80℃中保存。

• 注意事项：

寄送样本时请放入足量的干冰以保持低温条件【经验值：快递途中干冰消耗率约为 5KG/天，消耗速度与气温，泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系，请酌情添加干冰】。

收集方法参考文献：

[1]Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ，Analytical biotechnology, 2005.

[2]Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.

[3]Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: uenching and Extraction Protocols, metabolites, 2017.