经常做细胞实验的你，想必一定遇到过这个难题：细胞收集，究竟哪种方案＊合适？离心收集or瓶内裂解or胰酶消化？

01 

细胞收集方法优劣对比

离 心 法

优点：离心法操作方便，同时我们可根据收集到的细胞沉淀来加入适量的裂解液，从而 能够控制样品蛋白的浓度。

缺点：在离心过程中却容易造成细胞破碎而降低总蛋白得率，同时会造成细胞外基质 （ECM）的丢失，从而造成样品蛋白质图谱的不完整。

注：细胞外基质（ECM）是由细胞外大分子和矿物质（如胶原蛋白、酶、糖蛋白和羟基 磷灰石）组成的三维网络，为周围细胞提供结构和生化支持。因为多细胞在不同的多细胞谱 系中独立进化，细胞外基质的组成因多细胞结构而异；然而，细胞粘附、细胞间通讯和分化 是ECM的常见功能。细胞外基质主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋 白、蛋白聚糖与氨基聚糖，按分布部位划分主要分为基底膜（Basement membrane）和间 质基质(Interstitial matrix)

瓶 内 裂 解 法

优点：瓶内裂解法＊大的优点是可以有效的防止细胞在离心过程中破碎，能有效的提高 总蛋白得率，同时也能完整的保留细胞外基质（ECM）。

缺点：操作会相对复杂，且不易控制加入的裂解液量，往往会造成总蛋白浓度低且粘度 高等情况；对于一些药物处理的细胞和贴壁不牢的细胞，使用此方法在清洗阶段也容易造成 细胞大量丢失。

胰 酶 消 化 法

优点：胰酶处理的细胞个体形态单一，不聚团，对细胞损伤小。

缺点：会造成细胞外基质（ECM）的完全丢失，同时会剪切一些对胰酶敏感的蛋白，如 上图右。

对于WB蛋白样品中是否含有对胰酶敏感的蛋白，我们往往不太确定，同时胰蛋白酶也 属于外来蛋白质，如果不能做到彻底清除，同样会污染我们的样本。所以用于WB的细胞样 品不建议使用胰酶消化法收集细胞。

离心法：适用于悬浮细胞、贴壁不牢和药物处理过的细胞；

瓶内裂解法：适用于所有的贴壁细胞；

在一般情况下，我们首推瓶内裂解法，其次离心法；不推荐胰酶消化法。

02 

细胞收集protocol

a. 瓶内裂解法（效果＊佳）：适用于所有的贴壁细胞

1）吸净培养基，用冰的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取 残留的PBS。

2）在冰上加入适量预冷的裂解液于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细 胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30min，期间每10min 上下颠倒混匀一次。

b. 离心法：适用于悬浮细胞、贴壁不牢和药物处理过的细胞

1）使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500g离心5min，收集沉 淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。

2）加入适量的裂解液，在冰上放置30min，期间每10min上下颠倒混匀一次。

注：裂解液在使用前提前加入蛋白酶抑制剂，用于磷酸化抗体检测的需要同时加入蛋白酶 抑制剂和磷酸酶抑制剂。