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检测蛋白质磷酸化的方法

2021-04-12

蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的关注点之一。以下简要介绍几种常用的检测蛋白质磷酸化的方法。

1.westernblot

检测蛋白磷酸化状态的常用方法是western blot,过程是先用SDS-PAGE分离生物样品,接着转移到膜上,*后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Western blot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。磷酸化特异抗体大多灵敏,可检测常规样品中的磷酸化蛋白。

2.酶联免疫吸附分析(ELISA)

ELISA的定量能力比Western blot,有助于研究激酶活性调节及其功能。这种微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特异的捕获抗体,和磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中,加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与*初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。

3.激酶活性分析

蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分,它们影响了很多负责生物反应的下游效应物,因此,评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的,在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化,包括显色、放射性或荧光检测。

4.磷酸化特异抗体的开发

20世纪90年代,科学家利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子,开发出多个磷酸化状态特异抗体,这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中,产生高度特异的免疫试剂 。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在相关技术中使用磷酸化特异抗体都要注意,成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。

5.细胞内流式细胞术和ICC/IHC

通过流式细胞术和ICC来检测磷酸化蛋白要求蛋白稳定,且抗体能够接近。细胞通常经过刺激,并由甲醛或多聚甲醛来固定,以交联磷酸化蛋白,使其稳定,便于分析。固定后的细胞经过透化处理,让磷酸化特异抗体能够进入细胞。对于不同的亚细胞定位,通常使用不同的透化技术。

6.质谱

复杂的生物样品中蛋白质磷酸化的评估对于了解基于磷酸化的信号网络很重要。复杂的蛋白混合物中大规模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定,以及磷酸化残基的测序。质谱(MS)技术是进行这些研究的有力工具。

磷酸化修饰调控了广泛的细胞活性,包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯等,对于磷酸化的检测比较重要,以上列出了几种常用的检测蛋白磷酸化的方法,每种方法有其各自的优缺点,研究人员需根据实验设计挑选合适的方法。



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