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  • 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

    凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

    实验方法原理凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN**段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。实验材料DNA样品试剂、试剂盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-Free WaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBE buffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED(四甲基乙二胺)EMSA Gel-Shift结合缓冲液溴酚蓝仪器、耗材水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽实验步骤一、探针的标记 1.   如下设置探针标记的反应体系: (1)待标记探针 (1.75 pmol/微升) :2微升。 (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1微升。 (3)Nuclease-Free Water :5微升。 (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1微升。 (5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1微升。 (6)总体积 10微升 (7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。 2.   使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。 3.   加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。 4.   再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。 5.  标记好的探针**立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 二、 探针的纯化 通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作: 1.  对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。 2.   在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。 3.  在4℃,12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。 4.   在4℃,12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。 5.   加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针**立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。 三、EMSA 胶的配制 1.   准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。**选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。 2.   按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。 (1)TBE buffer (10X): 1毫升。 重蒸水 16.2毫升。 (2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2毫升。 (3)80% 甘油: 625微升。 (4)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) :150微升。 (5)TEMED :10微升 3.  按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。 四、EMSA结合反应 1.   如下设置EMSA结合反应 阴性对照反应: (1)Nuclease-Free Water :7微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 0微升。 (4)标记好的探针 :1微升。 (5)总体积 :10微升。 样品反应: (1)Nuclease-Free Water :5微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。 (4)标记好的探针: 1微升。 (5)总体积: 10微升。 探针冷竞争反应: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2微升。 (4)未标记的探针: 1微升。 (5)标记好的探针: 1微升。 (6)总体积 :10微升。 突变探针的冷竞争反应: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。 (4)未标记的突变探针: 1微升。 (5)标记好的探针: 1微升。 (6)体积 :10微升 Super-shift反应: (1)Nuclease-Free Water:4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。 (4)目的蛋白特异抗体 :1微升。 (5)标记好的探针:1微升。 (6)总体积 :10微升。 2.   按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。 3.   加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。 五、 电泳分析 1.  用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。 2.   把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。 3.   按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。 4.   剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 5.  干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。
  • 腺病毒服务

    腺病毒服务

    服务简介腺病毒是一种无包膜的球型结构的病毒,遗传物质为线型双股DNA形式。腺病毒的特点:(1)感染范围广对人致病性低;(2)对增殖和非增殖细胞均具有感染性;(3)能有效进行增殖;(4)病毒滴度高;(5)不整合到染色体中,无插入致突变性;(6)外源基因装载容量大。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域。技术特点※复制缺陷型腺病毒颗粒,对分裂期和非分裂期细胞均有感染作用;※无需任何转染试剂,操作简单;※适用于在难转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和In vivo 实验;※不适用于感染腺病毒以后细胞发生死亡和分化的敏感细胞和需要长期稳定表达目的基因的实验。腺病毒包装示意图生产流程服务说明1.       客户提供目的基因信息或模板(或干扰序列),如果提供模板,需提供详细的质粒信息。2.       目的基因序列**不要超过5kd,插入基因片段越大,滴度越低。
  • 载体构建

    载体构建

    载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术,是分子生物学研究常用的手段之一。将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证 包括:        1. 基因过表达载体构建        2. RNA干扰载体构建        3. miRNA表达/抑制载体构建        4. 荧光素酶靶基因3’UTR报告载体构建        5. 基因突变、载体改造等  技术路线: 我们提供:    1. 含目的片段的质粒、含该质粒的细菌各一份(RNA干扰载体提供三份,并筛选出至少一份干扰效率大于70%)    2. 引物序列、载体图谱一份、测序结果各一份    3. 载体构建实验所需试剂耗材、仪器设备、操作过程一份    4. 免费提供多种工具载体,多种报告基因示踪,多种亲和标签融合可选,以满足研究需要 结果示意图:       服务周期:服务内容说明价格实验周期载体构建(提供10ug)基因过表达载体基因<1.0Kb询价2周1.0Kb <基因<2.0Kb询价2-3周2.0Kb<基因<3.0Kb询价2-3周基因>3.0Kb询价2-3周RNA干扰载体shRNA载体3份并筛选出最佳询价3周miRNA过表达载体询价2周miRNA抑制载体询价2周荧光素酶靶基因报告载体询价2周  温馨提示:载体构建及改造所需的实验方案,目的基因序列及相关背景资料
  • 慢病毒包装

    慢病毒包装

    慢病毒载体可以将外源DNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细 胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高外源DNA的转导效率。根据构建好的基因过表达、RNA干扰、miRNA表达/抑制慢病毒载体,将重组病毒质粒及其辅助包装质粒共转染至包装细胞中,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定病毒滴度。  技术路线 :                                  技术特点:       慢病毒载体包装之后成为假病毒颗粒后,可用于       1.  感染原代细胞       2.  制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株       3.  in vivo的基因操作       4.  转基因动物,特别是转基因大鼠的制备 我们提供:      1.  提供1-5ml 滴度>108或109TU/ml慢病毒,并提供对应的空病毒对照      2.  提供滴度测定报告一份      3.  慢病毒包装所需试剂耗材、仪器设备、操作过程一份 结果示意图: 服务周期:服务内容说明价格实验周期载体构建(提供10ug)基因过表达载体基因<1.0Kb询价2周1.0Kb <基因<2.0Kb询价2-3周2.0Kb<基因<3.0K询价2-3周基因>3.0Kb询价2-3周RNA干扰载体shRNA载体3份并筛选出最佳询价3周miRNA过表达载体询价2周miRNA抑制载体询价2周荧光素酶靶基因报告载体询价2周慢病毒包装一般纯化滴度>1X108 TU/ml   提供量1ml询价2周滴度>1X108 TU/ml   提供量5ml询价2周 温馨提示:     1.  慢病毒在-80℃保存6个月,滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品,进行实验前,重新测一次滴度     2.  慢病毒应尽量避免反复冻融(小于3次)     3.  所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行,并佩戴一次性口罩和手套,尤其要避免病毒接触口、 眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域     4.  使用前从-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴锅中,轻轻晃动,使其尽快溶解,操作过程应置于冰盒上进行     5.  用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中,但**尽快用完 
  • 组织芯片

    组织芯片

    组织芯片又称组织微阵列,就是将数十至上千个小组织整齐排放在一张载玻片上而制成的组织切片。由于组织芯片制成的切片体积小,减少了人为筛选的无效组织,降低实验耗材成本,而且一次性实验即可获得大量结果,提高实验效率。组织芯片可用于组织中的DNA、RNA和蛋白质的定位分析和检测,如HE染色、免疫组织化学染色、DNA和RNA原位杂交、荧光原位杂交等。组织芯片克服传统病理学方法只能逐个研究切片的方式,可在一张切片上高通量获得组织形态学、基因和蛋白表达的信息。同时,避免了不同实验条件产生的结果误差,具有更强的可比性。   实验步骤:  1. 组织芯片的设计   2. 对目标蜡块组织的HE切片作形态学观察   3. 分别在目标组织切片和相应石蜡组织块上相应位置进行标记   4. 用阵列蜡块作5μm组织切片,经10%APES的丙酮溶液处理的载玻片   5. 烤片,37℃过夜,室温保存备用   我们提供:  1. 提供组织芯片包埋块   2. 提供组织芯片切片   3. 提供具体的实验方法、步骤、所用试剂、仪器、及相关分析数据等,实验结果将以电子或书面形式提交给您   结果示意图:                    服务周期:服务内容说明价格∕元实验周期组织芯片提供腊块询价10个工作日  温馨提醒: 1. 提供石蜡包埋的组织、附带一张HE染色切片  2. 提供实验必要的试剂和信息,例如组织来源和主要部位。 
  • 特殊染色

    特殊染色

     1. 油红O、苏丹III、苏丹IV、苏丹黑染色 脂类染色,用于证明脂肪变性,脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。2. Schiff氏法、AB/PAS染色法 糖原及粘液染色,用于某些血液病的诊断、鉴别诊断及疗效的观察3. 甲苯胺蓝染色 用于尖锐湿疣的初筛及肥大细胞的检测4. LFB染色 用于观察神经髓鞘和脊髓束变化等结果示意图:                  服务周期:服务内容说明价格∕元实验周期油红O、苏丹III、苏丹IV、苏丹黑染色客户提供染液询价3个工作日Schiff氏法、AB/PAS染色法客户提供染液询价3个工作日甲苯胺蓝染色客户提供染液询价3个工作日LFB染色客户提供染液询价3个工作日   温馨提示:  1. 以上染色为常见染色,如果需要做其他染色可以电话咨询  2. 以上染色需要客户提供染料
  • 免疫荧光

    免疫荧光

    抗原抗体反应,其具有高度的特异性。先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。实验步骤:   1. 固定   2. 清除内源性过氧化物酶   3. PBS洗   4. 封闭   5. 孵育一抗   6. PBS洗   7. 孵育二抗   8. PBS洗   9. DAPI复染   10. 封片   11. 荧光显微镜观察我们提供:  1. 提供完成实验的玻片  2. 每张切片提供一张200倍照片  3. 提供具体的实验方法、步骤、所用试剂、仪器、及相关分析数据等,实验结果将以电子或书面形式提交给您  4. 免费提供荧光二抗结果示意图:                    服务周期:                                                                              服务内容说明价格∕元实验周期IF单染建议做3张重复询价5个工作日IF双染建议做3张重复询价5个工作日IF三染建议做3张重复询价7个工作日Confocol拍照拍照倍数询价3个工作日 温馨提醒:1. 确保细胞或组织取材新鲜,固定及时2. 取材大小和固定方法正确,包埋面要求写清楚3. 提供实验必要的信息,例如组织来源、一抗来源和拍照要求   
  • 激光共聚焦(Confocal)

    激光共聚焦(Confocal)

    共聚焦显微技术(Confocal microscopy)是通过激光扫描共聚焦显微镜来获取细胞内某个薄层面上的荧光信息, 并结合计算机自动控制和信息收集功能,对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分析和整合, 从而得到丰富的细胞信息。   1. 消除了聚焦平面以外的荧光信号的干扰, 故成像清晰   2. 可以对样品不同层面进行连续逐层扫描, 再由计算机将这些图形重组为三维图像,图形清晰度高、层次分明、立体感更强   3. 可对细胞某个选定结构进行长度和体积的测量, 在分析细胞空间结构和某些物质的胞内精确定位方面具有明显的优势   4. 可同时实现多重指标的检测。目前,该技术应用范围已扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学激光共聚焦显微镜的应用:   1. 细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡等   2. 生物学、免疫学、环境科学和营养学:免疫荧光标记(单标、双标或三标)的定位,细胞膜受体或抗原的分布,微丝 微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位等。   我公司的技术强项在于研究蛋白之间的共定位以及蛋白和细胞器的共定位服务流程:   1. 构建质粒   2. 共转细胞   3. 免疫荧光   4. 激光扫描共聚焦显微镜扫描我们提供:   1. 提供多种带flag(包括荧光蛋白)的质粒:myc, HA, n-flag, GFP等   2. 提供构建好的载体质粒,并附上测序结果   3. 提供共定位图片   4. 提供具体实验方法、步骤、所用试剂、仪器、及相关分析数据等,实验结果将以电子或书面形式提交给您结果示意图: 服务周期:服务内容价位周期说明单色标记询价10个工作日包含DAPI染核双色标记询价询价三色标记询价询价 客户提供:   1. 提供已构建好的目的基因表达质粒(提供测序图谱)或基因的名称、序列   2. 提供细胞系和细胞培养的详细步骤   3. 提供抗体或细胞器的特异性Marker
  • 石蜡包埋及切片

    石蜡包埋及切片

    其基本原理用固定剂石蜡固定组织、细胞以及各种亚细胞器,保持组织微细结构,制成薄片,并用不同的染色方法增加各部分色差,在显微镜下观察组织、细胞的形态结构,或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分,并可进行形态和化学成分的定量分析实验步骤:                          我们提供:   1. 提供蜡块和标签   2. 切片服务周期:服务内容说明价格∕元实验周期石蜡包埋普通组织,特殊组织询价询价3个工作日切片3-5μm询价3个工作日 温馨提示:  1. 确保细胞或组织取材新鲜,固定及时  2. 取材大小和固定方法正确,包埋面要求写清楚  3. 提供实验必要的信息,例如组织来源,切片厚度  4. 我们普通包埋是用全自动包埋仪包埋,如有特殊要求请在签单之前说明,费用另算
  • Tunel(凋亡)

    Tunel(凋亡)

    TUNEL是分子生物学与形态学相结合的一种研究方法。细胞凋亡过程中,染色体DNA发生双链断裂或单链断裂,从而产生大量带有游离3'末端的DN**段。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)可以将荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而对凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色,检测细胞凋亡。TUNEL法是在细胞和组织层次上进行生物学反应,结果直观,便于观察;可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高。 实验步骤:   1. 充分脱蜡和水化   2. 3%过氧化氢甲醇中浸洗10min,抑制内源性过氧化氢酶   3. 用蛋白酶K(20μg/ml溶于Tris/HCl中,pH7.4~8.0)室温孵育15min   4. PBS洗2次,每次5min,擦干样品周围的水   5. 此阶段配制TUNEL反应混合物——从试剂2中取出100μl标记溶液作为两个阴性对照;将试剂1中取5μl+试剂2中45μl标记液中,配成50μl TUNEL反应混合物混匀(即配即用,4℃避光)   6. 标记反应:滴加50μl的TUNEL反应混合液,在湿盒中37℃孵育60min。PBS洗3次,每次5min,至此样品可在荧光显微镜下(绿色)分析结果   7. 信号转化和分析:擦干样品周围的水分,加入50ul转化剂-POD,湿盒中37℃孵育30min。PBS洗5min*5次   8. 加入50~100μl DAB底物溶液,室温(10~25℃)孵育5 min,PBS洗5min*3次   9. 中性树胶或者甘油封片(在封片前可以复染),光镜下分析结果我们提供:   1. 提供完成实验的玻片   2. 提供具体的实验方法、步骤、所用试剂、仪器、及相关分析数据等,实验结果将以电子或书面形式提交给您结果示意图:                         服务周期:服务内容说明价格∕元实验周期Tunel凋亡提供白片询价3个工作日 温馨提醒:   1. 提供新鲜的组织、固定过的组织、石蜡包埋的组织、细胞爬片、石蜡切片、冰冻切片   2. 提供具体的拍照部位 
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