加入收藏
全国免费热线:400-7780-786

<细胞凋亡的检测方法>

2013-08-27

 

(一)   测原理

细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

(二)   用价值

流式细胞仪检测有下列特点:(1)检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确;(2)可用许多相关分析;(3)结合被测细胞DNA含量分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。但该法周样也具有标本制作复杂。非原位检测,不易与变性细胞鉴别等因素的限制。

1. 检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,采用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

常用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有拒染性,荧光着色很浅,凋亡细胞主要摄取hoechs-PI染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈红色荧光。

2.DN**段原位标记

凋亡细胞DN**段原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,UDTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidy1 transferase,TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3的羟基(-OH)端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DN**段原位标记法有两种:(1)原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,该技术是1994年由Fehsel等提出,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3-OH端;(2)原位缺口末端原位标记技术(in situ end labelling technique,ISEL), 该技术即TUNEL法,于1993年由Wijsman等提出,它是利用TdT将标记DUTP接到3-OH端。研究证明,TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应,故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性,但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。

3.检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法

(1)检测原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧。磷脂酰结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它与PS具有高度的亲合力。因此,Annexin V可以作为控针检测暴露在细胞膜表面的PS。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V, 将Annexin V标记上荧光素,同时结合PI拒染法进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

(2)结果判断:正常活细胞Annexin V、PI 均低染;凋亡细胞Annexin V 高染、PI低染;坏死细胞Annexin V、PI 均高染。

(3)应用价值:细胞发生凋亡时,膜上PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V 联合检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V 联全PI染色法不需固定细胞,可避免PI染色法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法固定造成的DN**段丢失。因此,Annexin V联合法PI更省时,结果亦更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。


加载中
  • 电话咨询
  • 400-7780-786
  • 021-34681336
您是第 1600370 位访客!